RESUMO

A toxocaríase humana acomete o homem por meio da ingestão de ovos embrionados de T.canis. Geralmente, as infecções são assintomáticas, mas podem apresentar quadros graves como alterações pulmonares, distúrbios neurológicos e comportamentais e a perda da visão. Seu diagnóstico é principalmente imunológico. No Instituto Adolfo Lutz (IAL), o imunodiagnóstico de toxocaríase é realizado por meio de um ensaio imunoenzimático in-house (ELISA-IAL). O objetivo deste trabalho foi verificar o desempenho de um kit comercial ELISA (Ridascreen) para detecção de toxocaríase, em comparação ao ELISA-IAL, empregando-se o índice Kappa e taxas de sensibilidade e especificidade relativas. Foram analisadas 170 amostras de soro da rotina laboratorial de toxocaríase humana, paralelamente nos ensaios de ELISA-IAL e Ridascreen. Observou-se uma concordância substancial e taxas de sensibilidade e especificidade relativas de 88% e 75%, respectivamente. Considerando estes resultados, sugerimos que o kit comercial avaliado pode ser empregado alternativamente ao ELISA-IAL para o diagnóstico da toxocaríase humana.

PALAVRAS-CHAVE: Toxocaríase. Toxocara canis. Diagnóstico. ELISA.

ABSTRACT

Human toxocariasis affects humans through the ingestion of embryonated eggs of T.canis. Generally, infections are asymptomatic, but may present severe symptoms as pulmonary, neurological and behavioral disturbs or even visual loss. The human toxocariasis diagnosis is mainly immunological. At Instituto Adolfo Lutz (IAL) the immunodiagnosis of toxocariasis has been performed using an in-house enzyme-linked immunosorbent assay (IAL-ELISA). The aim of this study was to verify the performance of a commercially available ELISA kit (Ridascreen), as compared to the IAL-ELISA, employing the Kappa test and relative sensitivity and specificity rates.
A total of 170 sera from the routine laboratory of human toxocariasis were analyzed, in parallel, by means of IAL-ELISA and Ridascreen ELISA. Substantial level of agreement and relative rates of sensitivity and specificity of 88% and 75%, respectively, have been observed.
Considering these results, we suggest that the commercially available kit evaluated can be used alternatively to the IAL-ELISA for human toxocariasisT diagnosis.

KEY WORDS: Toxocariasis. Toxocara canis. Diagnosis. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay.

INTRODUÇÃO

A toxocaríase humana é uma zoonose, que se caracteriza pela migração e persistência de larvas de nematódeos, em especial de Toxocara canis, nos tecidos de hospedeiros não habituais (paratênicos).^{1, 2}

O homem é um hospedeiro paratênico e pode se infectar pela ingestão de ovos embrionados de T. canis presentes em solo contaminado ou em carnes cruas de outros hospedeiros paratênicos.³ A larva é liberada no intestino delgado, atravessa a mucosa e, pela veia porta, atinge o fígado, onde pode se encapsular ou migrar para outros órgãos, como pulmões, coração e olhos, pela circulação sistêmica.⁴

Geralmente as infecções por T. canis são assintomáticas, mas podem apresentar quadros graves, dependendo da carga parasitária, migração larvária e resposta imune do hospedeiro, sendo descritas três formas clínicas da doença:^{4, 5}

§ Toxocaríase Visceral: febre, hepatomegalia, alterações pulmonares, miocardite, distúrbios neurológicos;

§ Toxocaríase Ocular: estrabismo, endoftalmite, corioretinite, granuloma retinino, uveíte, perda de visão;

§ Toxocaríase Oculta: tosse, dor abdominal, cefaleia, distúrbios comportamentais.

Ao contrário do que ocorre nos hospedeiros canídeos, no homem, a larva de T. canis não completa seu ciclo, portanto, não há liberação de ovos nas fezes. Sendo assim, o diagnóstico da toxocaríase humana é feito, principalmente pela avaliação da presença de anticorpos específicos anti-T. canis no soro ou outros fluidos biológicos (imunodiagnóstico) de indivíduos com epidemiologia, sinais e sintomas característicos da infecção.

No Instituto Adolfo Lutz, o imunodiagnóstico de toxocaríase humana tem sido realizado há mais de 25 anos por meio de um ensaio imunoenzimático – ELISA padronizado in-house (ELISA T. canis IAL) a partir da técnica descrita por Camargo e colaboradores⁷, que permite a determinação de anticorpos da classe IgG no soro com emprego do antígeno de excreção e secreção da larvas de T. canis (TES).

OBJETIVO

O objetivo desta avaliação foi verificar o desempenho de um kit de reagentes, disponível comercialmente em nosso meio para detecção de anticorpos IgG anti-T. canis (Ridascreen/R-Biopharm), frente ao ELISA T. canis IAL.

METODOLOGIA

De agosto a setembro/2010, todas as amostras de soro encaminhadas ao Instituto Adolfo Lutz para imunodiagnóstico da toxocaríase humana foram analisadas paralelamente, empregando-se o teste de ELISA T. canis IAL, padronizado no Instituto Adolfo Lutz com base na técnica descrita por Bach-Rizzati⁶ e com pequenas modificações introduzidas por Camargo e colaboradores,⁷ e o teste de ELISA Ridascreen (R-Biopharm/Alemanha), executado estritamente de acordo com as recomendações contidas na bula do fabricante. Em ambos os testes as amostras são classificadas como “reagentes” ou “não reagentes”, dependendo dos valores de absorbância dividido pelo cut-off da reação (Índice cut-off), considerando-se o valor de corte igual a 1,0. O grau de concordância entre os dois testes foi avaliado por meio da aplicação do teste Kappa⁸ e o desempenho global foi verificado por meio das taxas de sensibilidade e especificidade relativas,⁹ considerando-se o ensaio ELISA T. canis IAL como teste de referência.  As absorbâncias das amostras com resultados discordantes nos dois testes foram analisadas quanto à distância do valor de corte por meio de gráfico de dispersão.

RESULTADOS

Foram analisadas, prospectivamente, 170 amostras de soro provenientes da rotina diagnóstica de toxocaríase humana do Laboratório Central do Instituto Adolfo Lutz. Destas, 83 (49%) foram classificadas como “reagentes” e 87 (51%) como “não reagentes” para anticorpos IgG anti-T. canis, empregando-se o teste de referência. Entre as 83 amostras “reagentes” no teste de referência, 12% foram “não reagente” (falso-negativas) no teste ELISA Ridascreen. Por outro lado, entre as 87 amostras “não reagentes” no teste de referência, foram observados 25% de resultados reagentes (falso-positivas), quando se empregou o teste ELISA Ridascreen.  A descrição dos resultados obtidos nos dois ensaios encontra-se na tabela 1.

Tabela 1. Detecção de anticorpos IgG anti-T.canis. Comparação entre resultados obtidos empregando-se o ELISA in house do IAL e o ELISA comercial Ridascreen/R-Biopharm.

		ELISA in house
ELISA comercial		Reagente	Não Reagente	Total
	Reagente	73	22	95
	Não Reagente	10	65	75
	Total	83	87	170

 

Aplicando-se o teste Kappa ao conjunto de resultados dos dois ensaios, observou-se índice de concordância de 0,62, considerado substancial.⁸ A sensibilidade e a especificidade relativas do ELISA Ridascreen foram, respectivamente, de 88% e de 75%.

Quanto à dispersão dos valores de absorbância das amostras que apresentaram resultados discordantes por meio do teste de ELISA Ridascreen, observou-se (Figura 1) que as amostras com resultados falso-negativos apresentaram, no teste de referência, valores de absorbância relativamente baixos, embora acima do valor de corte do referido teste. Quanto às amostras falso-positivas, a dispersão dos respectivos valores de absorbância no teste de referência indica distribuição homogênea próximo ao valor de corte do mesmo, porém inferior a este.

Figura 1. Distribuição dos resultados discordantes entres os testes ELISA para detecção de anticorpos IgG anti-T.canis in house do IAL e o comercial Ridascreen/R-Biopharm (valor de corte = 1).

DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

Conforme pode ser verificado na tabela 2, o teste comercialmente disponível avaliado neste estudo emprega a mesma composição de antígenos utilizados na confecção do teste de fabricação in-house do IAL e ambos se baseiam na detecção de anticorpos da classe IgG. O teste comercial é de fácil execução e a obtenção dos resultados é mais rápida, em vista do menor tempo de execução.

Tabela 2. Comparação entre as técnicas utilizadas para detecção de anticorpos anti-T. canis

	ELISA comercial	ELISA “in-house”
Antígeno	Excreção e secreção de larvas de T. canis	Excreção e secreção de larvas de T. canis
Absorção de amostras	Não são absorvidas	Absorção com extrato de Ascaris suum
Anticorpo detectado	IgG	IgG
Reagentes	Prontos para uso	Preparados no laboratório
Tempo total de reação	1 hora	3 horas

Considerando os resultados apresentados, o índice de concordância (Kappa) observado entre o teste comercial e o teste de referência foi aceitável. Isto indica que os dois testes podem ser empregados alternativamente um ao outro para a mesma finalidade. Quanto aos resultados discordantes, a análise da dispersão das absorbâncias das amostras nos dois testes sugere que resultados falso-negativos no teste ELISA Ridascreen poderiam ser atribuídos a amostras com baixas concentrações de anticorpos específicos.

Por outro lado, resultados falso-positivos observados no ELISA Ridascreen podem ser atribuídos a reações inespecíficas devido ao fato de as amostras de soro não serem absorvidas com extrato de Ascaris sp., procedimento que diminui as reações cruzadas com outros parasitas, muito freqüentes em países tropicais. Observamos também que a especificidade relativa do teste comercial apresentou índices ainda mais baixos quando os ensaios realizados em data próxima à data de validade do kit (dados não mostrados).

O presente trabalho é resultado de um estudo modesto e com limitações, tendo em vista o número pequeno de amostras analisadas, a falta de informações clínicas dos pacientes e a não possibilidade de avaliação de diferentes lotes do kit de reagentes comercial, entre outras. Apesar disto, com base no índice de concordância observado nesta casuística, sugerimos que o ensaio comercial ELISA Ridascreen pode ser utilizado alternativamente ao ensaio ELISA IAL para o atendimento da rotina de imunodiagnóstico da toxocaríase humana, sem impacto  significativo para o desempenho global do serviço prestado.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1.     Beaver PC, Snyder H, Carrera G, Dent J, Lafferty J. Chronic eosinophilia due to visceral larva migrans. Report of three cases. Pediatrics. 1952; 9: 7-19.

2.     Beaver PC. Larva migrans: a review. Exp. Parasit. 1956; 5: 587-621.

3.     Santarém VA, Rubinsky-Elefant G, Chesine PAF, Leli FN. Toxocaríase canina e humana. Vet. e Zootec. 2009; 16(3): 437-447.

4.     Abe-Jacob CM, Oselka GW. Toxocariase na infância. Pediatria (São Paulo). 1991; 13(2): 48-55.

5.     Chieffi PP, Santos SV, Queiroz ML, Lescano SAZ. Human toxocariasis: contribution by Brazilian researchers. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo. 2009; 51(6): 301-308.

6.     Bach-Rizzati BC. Desenvolvimento do teste imunoenzimático ELISA para o diagnóstico da toxocaríase humana. São Paulo, 1984. [Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo]

7.     Camargo ED, Nakamura PM, Vaz AJ, Silva MV, Chieffi PP, Melo EO. Standardization of DOT-ELISA for the serological diagnosis of toxocariasis and comparison of the assay with ELISA. Rev. Inst. Med. trop. S.Paulo. 1992; 34:55-60.

8.     Landis JR, Koch GG. The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics. 1977; 33: 159-74.

9.     Pereira MG. Epidemiologia Teoria e Prática. 10ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan; 2006.