Marluci Monteiro Guirado, Hermione Elly Melara de Campos Bicudo  

Laboratório de Vetores. Departamento de Biologia. Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho". São José do Rio Preto, SP, Brasil

Resumo

A dengue, na forma clássica ou hemorrágica, uma das doenças transmitidas pelo mosquito Aedes aegypti, é um importante problema de saúde pública. Atualmente, a área de ocorrência, bem como o número de pessoas afetadas pela doença, vem aumentando paralelamente à preocupação com o seu controle. Os esforços para produzir uma vacina efetiva na prevenção da dengue ainda não mostraram o sucesso desejado. Ao mesmo tempo, métodos para o controle do tamanho das populações utilizando técnicas genéticas modernas, como a construção de mosquitos transgênicos portadores de características apropriadas, ainda permanecem em estudo laboratorial. Assim, enquanto outros processos não estiverem disponíveis, o controle do mosquito estará quase exclusivamente dependente da conscientização das populações humanas na eliminação dos criadouros em potencial. Alguns aspectos e problemas envolvidos nesse assunto são abordados no presente texto.

Palavras-chave: Aedes aegypti; problemas de controle; perspectivas.

Abstract

Dengue in the classic or hemorrhagic form, one of the diseases transmitted by the mosquito Aedes aegypti, is an important public health problem. Presently, the occurrence area as well as the number of people affected by this disease is increasing in parallel with the human concern about its control. The efforts to produce a vaccine effective in the prevention of dengue did not show yet the desired success. In addition, methods for control the mosquito population size using modern genetic techniques, such as the construction of transgenic mosquitoes bearing appropriate characteristics, remain yet under laboratory studies. Thus, while other processes are not available, the mosquito control is almost exclusively dependent on the conscious involvement of the human populations for eliminating the potential mosquito breeding sites. Some aspects and problems related to this subject are dealt with in the present text.  

Aedes aegypti: controle, dificuldades e perspectivas

O controle do Aedes aegypti, mosquito vetor dos vírus causadores da febre amarela e dengue, na forma clássica ou hemorrágica, é hoje um dos principais problemas de saúde pública em muitas regiões do mundo, incluindo o Brasil. A gravidade dessas doenças, o fato de que apenas para a febre amarela existe vacina e, paralelamente, a dificuldade em controlar o tamanho populacional do mosquito estão na base dessas preocupações.

A dengue é encontrada em regiões tropicais e subtropicais do planeta, predominando em áreas urbanas e semiurbanas. Hoje, é endêmica em mais de cem países das Américas, África, Ilhas do Pacífico, Ásia e Mediterrâneo. A situação é agravada pelo fato de que a doença continua a se espalhar para novas áreas. Atualmente, o sudeste da Ásia e o oeste do Pacifico são consideradas as regiões mais fortemente afetadas pela doença, sendo que na maioria dos países da Ásia a dengue hemorrágica tornou-se uma das principais causas de hospitalização e morte infantil¹.

Nas últimas décadas, a incidência da doença tem crescido acentuadamente. Hoje, estima-se em 50 milhões o número total de pessoas afetadas anualmente em todo o mundo, com expressiva mortalidade devida à dengue hemorrágica¹. Mas, há estatísticas que mencionam até 100 milhões de casos ao ano².

Não há dúvida de que o recente sequenciamento do genoma do A. aegypti, envolvendo pesquisadores de várias universidades^3,4, poderá ser um auxiliar importante na detecção de processos e de ferramentas para o controle do mosquito. Porém, a experiência que já se tem com outros organismos tem levado à conclusão de que o sequenciamento gênico de um organismo é “um novo começo”, no que se refere às dificuldades iniciais que podem fazer com que resultados significativos demorem um tempo imprevisível para aparecer. 

Na manipulação do genoma, complexas interações gênicas geralmente são quebradas, e por serem desconhecidas em sua extensão geram, na maioria das vezes, resultados inesperados e ineficientes. Haja vista os vários exemplos de construção, em diferentes laboratórios, de vetores transgênicos (aqui se incluem algumas espécies de Anopheles e A. aegypti) que não se deixam infectar pelos agentes que eles normalmente abrigam e transmitem^5,6,7.

No Brasil também tem havido esforços nesse sentido; pesquisadores do Centro de Pesquisa René Rachou, unidade da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) em Minas Gerais , também desenvolveram uma linhagem transgênica de Anopheles, incapaz de se infectar pelo Plasmodium causador da malária⁸.

Porém, os mosquitos geneticamente modificados, que geralmente têm tido um bom desempenho em laboratório, quando estão sozinhos são rapidamente eliminados na competição com o mosquito “normal”, transmissor. Seu genoma é produto de milhares de anos de julgamento pela seleção natural, e sua capacidade reprodutiva, muito maior, tem-lhe assegurado até agora esse sucesso.

Assim, apesar da variação dos processos utilizados nos diferentes laboratórios em sua construção, os mosquitos transgênicos apresentam desvantagens, relacionadas no mínimo com a capacidade reprodutiva diminuída. Para Anopheles tem havido algum sucesso em resolver esse problema⁷, mas há ainda um longo caminho a percorrer. Além das dificuldades de ordem biológica, a experimentação desses organismos transgênicos na natureza esbarra em aspectos de segurança e ética, difíceis de contornar.

Por outro lado, a obtenção de uma vacina contra a dengue ainda pode demandar um tempo relativamente longo. Segundo os pesquisadores da Fiocruz, que há oito anos realizam pesquisas com esse objetivo, o Brasil poderá ter essa vacina em 5 a 10 anos. Essa construção está sendo tentada por meio de manipulação dos vírus da dengue e de combinações feitas com o da febre amarela, que é parecido com o vírus da dengue. Embora esses pesquisadores mencionem que o País gasta anualmente cerca de 10 milhões de reais em pesquisas para obtenção da vacina, o trabalho é dificultado pela existência de quatro sorotipos diferentes da dengue, cuja vacina deverá ser eficiente para todos⁹.

Atualmente, laboratórios dos Estados Unidos, França e Cuba também estão buscando desenvolvê-la. Aparentemente, os norte-americanos estão mais adiantados nesse processo, havendo uma perspectiva de aproximadamente quatro anos para utilização da vacina, que envolverá uma parceria com o Brasil em sua etapa final¹⁰.

As dificuldades existentes indicam que ainda durante um tempo, mais ou menos longo, vamos continuar dependentes exclusivamente dos métodos de controle da dengue por meio do controle do A. aegypti, hoje subordinado, grandemente, ao comprometimento da população com a eliminação dos criadouros (recipientes que podem acumular água onde a fêmea ovipõe e os ovos se desenvolvem, passando pelas fases de larva, pupa e adulto). Entre os criadouros mais comuns estão os pratos e vasos de planta, bebedouros de animais, pneus, ralos externos e internos, calhas, lajes e materiais inservíveis, entre outros.

No Brasil, o A. aegypti foi eliminado na década de 1950. Contudo, a partir de meados dos anos 1970 o País se reinfestou e, hoje, o mosquito ocorre em todos os Estados, já tendo causado sérias epidemias em grande número de municípios. A maior e mais recente atingiu a capital do Rio de Janeiro, em 2008, causando a morte de mais de uma centena e meia de pessoas, em um total de 209.310 casos notificados em todo o Estado¹¹.

O Brasil já abriga os quatro sorotipos de vírus causadores da dengue (DEN1, DEN2, DEN3 e DEN4). Embora haja ainda alguma discussão sobre a veracidade do fato, o vírus sorotipo 4 (DEN4) foi isolado de alguns doentes de Manaus (AM), em 2007, por pesquisadores da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas², e teria sido introduzido em território brasileiro a partir da Venezuela. Caso se confirme, a tendência é que o sorotipo se espalhe para as demais regiões do País.

A presença de mais um sorotipo de vírus amplia a probabilidade das pessoas contraírem um segundo acometimento de dengue, aumentando consequentemente a ocorrência de maior número de casos de dengue hemorrágica. Sabe-se que mesmo as pessoas infectadas pela primeira vez por um dos sorotipos de vírus da doença podem manifestar sua forma hemorrágica, mas a chance disso acontecer aumenta quando há uma nova infecção. Aparentemente, a imunização é específica para cada sorotipo.

Desde o ressurgimento da dengue no Brasil, as principais estratégias adotadas pelos municípios para controlar a proliferação do mosquito têm sido atividades educativas e a fiscalização das residências, por agentes de saúde, em busca de criadouros para eliminar os focos de reprodução do A. aegypti. A aplicação ou nebulização dos inseticidas organofosforados e piretróides – cujos efeitos deletérios ao homem e, especialmente, ao ambiente são bastante conhecidos^12,13 – tem sido utilizada em situações epidêmicas. Acresce que o uso intensivo desses compostos nos últimos 25 a 30 anos tem causado o desenvolvimento de resistência em populações do mosquito em muitas regiões brasileiras^14-19. Em outros países, a constatação tem sido a mesma^20-24.

Alternativas aos inseticidas

Visando a redução ou substituição o uso de inseticidas, em razão dos seus efeitos negativos já mencionados, pesquisadores têm buscado e obtido algumas formas alternativas de controle, as quais causam a morte das larvas em seus próprios criadouros, sendo importantes especialmente quando estes não podem ser eliminados.

O primeiro método de controle a ser utilizado foi o Bti, que envolve o uso dos Bacillus thuringiensis israelensis (Bti), os quais produzem proteínas conhecidas como d-endotoxinas, tóxicas para as larvas de mosquitos e outros insetos^25-30. O uso desse tipo de bioinseticida, porém, não é desprovido de problemas. Há quem os considere mais adequado para o controle de vetores que se criam em quantidades grandes de água, como pântanos, rios e lagoas, não sendo adequado do ponto de vista prático para vetores que se reproduzem em pequenos depósitos temporários, caso do A. aegypti³¹. Uma desvantagem de seu uso em ambientes externos é o baixo efeito residual, devido principalmente à exposição direta à luz solar, que inativa a toxina pela luz ultravioleta^32-35,29.

Por outro lado, desde 1985, a literatura tem noticiado casos de resistência ao Bti, em várias regiões do mundo, em algumas espécies de mariposas que são pragas de sementes. Em laboratório, de 13 espécies de insetos analisadas 11 desenvolveram resistência a várias linhagens de Bti. Aedes aegypti é uma delas, mas sua resistência parece não ter sido ainda detectada no campo^36,37. Foi, porém, detectada resistência ao Bti em Culex pipiens em Syracuse, Nova York (EUA)³⁸.

Até alguns anos atrás, o Bti usado no Brasil era importado. Hoje já é produzido no País. A Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia produz o Bt-horus, desenvolvido a partir do Bacilus thuringiensis³⁹.

Cafeína e borra de café são outras alternativas aos inseticidas. O processo, desenvolvido por pesquisadores do Departamento de Biologia da Universidade Estadual Paulista (Unesp) de São José do Rio Preto (SP), em testes repetidos dezenas de vezes desde 2000, mostra que as duas substâncias bloqueiam o desenvolvimento das larvas de A. aegypti, causando sua morte nessa fase^40,41,42. Em laboratório, a cafeína na concentração de 1,0 mg/ml, causa a mortalidade de 100% das larvas do mosquito, geralmente em 24 a 48 horas de exposição^40,41,43, e o efeito residual observado foi de sete meses⁴³.

Já a borra do café, devido às suas características físicas, é mais indicada para criadouros em potencial nos jardins (como vasos e bromélias); é eficiente na concentração de 300 mg/ml (para uso da população, corresponde a aproximadamente quatro colheres de sopa cheias para um copo ou 200 ml de água). Nova borra de café deve ser aplicada em intervalos de sete dias^40,42.

Inúmeras pesquisas com extratos de plantas, produzidas em diferentes locais, têm sido divulgadas pela mídia de maneira crescente, todas com o objetivo de realizar o controle do mosquito na fase de larva. É o caso do trabalho realizado por pesquisadores da Fiocruz, que desenvolveram um produto feito a partir de uma substância extraída da Piper solmsianum, planta da família das pimentas, que ocorre na Mata Atlântica. Segundo as informações⁴⁴, a fórmula já teve eficácia comprovada em laboratório. Ainda de acordo com a notícia, agora os pesquisadores vão começar a fazer testes de campo e levantamento de custos, etapas necessárias para definir a produção do larvicida, que pode chegar ao mercado em quatro anos⁴⁴.

Relatos sobre a descoberta de outras substâncias larvicidas têm sido predominantemente veiculados pela mídia. Entre eles, as pesquisas de cientistas da Universidade do Sul de Santa Catarina (USSC) envolvendo as plantas andiroba, cinamomo e uma substância sintética não revelada⁴⁵; as descobertas dos pesquisadores da Universidade Federal do Paraná (UFPR), que usam o extrato etanólico de sementes trituradas de Melia azedarach, popular cinamomo ou Santa Bárbara⁴⁶; de uma equipe do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará (UFC) que recomenda um chá ou extrato de algumas plantas medicinais conhecidas naquela região (agrião-bravo, alfavaca, alho, capim-santo, cidreira, hortelã, limão ou mastruz)⁴⁷; e, ainda, de pesquisadores dos Departamentos de Bioquímica, Química Fundamental e Histologia e Embriologia da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), envolvendo o uso da proteína lectina encontrada nas sementes da Moringa oleifera e na madeira da aroeira do sertão (Myracrodruon urundeuva)⁴⁸.

Todos esses estudos e muitos outros citados na mídia visam ao controle da população do mosquito A. aegypti pela interrupção do ciclo biológico na fase de larva. Alguns desses relatos têm aparecido, também, em recentes publicações científicas^49,50,51.

A cafeína tem várias vantagens sobre muitas ou todas essas descobertas, sendo mais uma alternativa para uso em saúde pública. Entre essas vantagens estão a disponibilidade no mercado (por ser normalmente utilizada para outros fins, como a adição em numerosos medicamentos, cosméticos e bebidas) e a não necessidade de culturas específicas e da montagem de laboratórios. A borra do café, por sua vez, é um produto geralmente jogado fora depois do preparo da bebida, que é diário em grande número de lares, não só do Brasil.

Qualquer que seja o produto que se utilize para o controle do mosquito, o desenvolvimento de resistência pode se estabelecer com o tempo. Testes realizados com a cafeína em laboratório não indicaram desenvolvimento de resistência; ao contrário, houve redução da oviposição e do desenvolvimento dos ovos por gerações, até que nenhum ovo eclodiu na oitava geração⁴¹. Porém, não se pode garantir que na natureza ocorra o mesmo processo.

Mecanismos de desenvolvimento de resistência em insetos com ênfase em Aedes aegypti

A resistência dos insetos aos inseticidas é, hoje, um dos assuntos centrais quando se trata de vetores de doenças ou pragas da agricultura, uma vez que ela dificulta ou mesmo inviabiliza programas de controle. De modo geral, os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento de resistência são ainda pouco conhecidos, podendo mesmo ser diferentes para um mesmo organismo, em diferentes localidades e em relação a diversos inseticidas.

Em A. aegypti, a primeira informação sobre o desenvolvimento de resistência a inseticidas data de 1950 e refere-se a uma população do mosquito originária do Caribe, em relação a organofosforados⁵². Posteriormente, foram surgindo outros trabalhos mostrando a ocorrência de resistência a organofosforados e piretróides, em regiões tropicais e subtropicais que são as de ocorrência desses mosquitos^53,54,12,31. No Brasil, em vários municípios, já antes do ano 2000, foi detectado o desenvolvimento de resistência ao inseticida organofosforado temefós usado como larvicida^55,56,14, assim como o Malathion^Ò, utilizado para o combate aos mosquitos adultos.

O nível de resistência dos organismos é dependente da concentração, da frequência e do tempo durante o qual os inseticidas são aplicados⁵⁷. Por sua vez, algumas características biológicas dos mosquitos, que incluem o curto ciclo de vida e a descendência numerosa, favorecem o desenvolvimento de resistência, pois facilitam o aparecimento de indivíduos resistentes, que são selecionados em áreas tratadas⁵⁸.

Os estudos da resistência a inseticidas têm mostrado que ela é decorrente de três tipos principais de mecanismos: (a) redução da penetração do inseticida, devido a alterações da cutícula do inseto⁵⁹; (b) aumento do metabolismo do inseticida por ação de esterases, monooxigenases ou glutationa – transferases^60,61; e (c) por modificação do alvo do inseticida^62,63. A literatura registra ainda um mecanismo de resistência comportamental, no qual os insetos evitam o contato com locais que contenham a substância tóxica⁶⁴.

As esterases estão envolvidas no desenvolvimento de resistência em vários insetos, incluindo moscas, borboletas e mosquitos dos gêneros Culex e Anopheles^65-71. Também no gênero Aedes esse envolvimento já está demonstrado, como será mencionado mais adiante. As classes de esterases geralmente relacionadas ao desenvolvimento de resistência são as carboxilesterases e as colinesterases. As carboxilesterases agem na degradação do inseticida. Na maioria dos casos, a resistência que elas fornecem é decorrente de amplificação do número de genes ou aumento da atividade por ação de mecanismos de regulação, que geram aumento da síntese do produto correspondente^72,62.

No caso das colinesterases, a resistência surge por mutação gênica. A acetilcolinesterase (ACE) é o principal alvo dos inseticidas organofosforados e carbamatos, que agem fosforilando ou carbamilando o resíduo de serina no interior do sítio gorge⁷³. Isso compromete a função da ACE, que é catalizar a hidrólise da acetilcolina, um neurotransmissor essencial para a transmissão colinérgica no sistema nervoso dos insetos. Mutações no gene da ACE tornam o produto gênico insensível à ação dos inseticidas, produzindo resistência. A insensibilidade da ACE é um mecanismo frequente de resistência em insetos, sendo que esse processo tem sido associado a mutações do gene ace em vários organismos, como Drosophila⁶², Musca domestica⁷⁴, Culex pipiens e Anopheles gambiae⁷⁵ e a mosca Bactrocera dorsalis⁷⁶.

Em geral, as populações brasileiras resistentes de A. aegypti têm apresentado níveis maiores da atividade esterásica, mas os perfis de ACE e da oxidase não têm mostrado alteração⁵⁶. Em uma população de Santiago de Cuba, embora tenha sido detectada a presença do mecanismo de ACE insensível, parece que não foi ainda investigada a existência de mutações no gene ace⁶³.

A maioria dos trabalhos em A. aegypti voltados à análise dos perfis esterásicos refere-se à quantificação de esterase total, avaliada no extrato de mosquitos macerados inteiros^77,78. Trabalhos realizados no Laboratório de Vetores do Departamento de Biologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (Ibilce/Unesp), em que as próprias bandas foram analisadas em géis de poliacrilamida, sugeriram que não ocorre apenas aumento da atividade esterásica, mas também aumento da frequência de algumas bandas esterásicas e redução da frequência de outras, sugerindo a ativação preferencial de determinadas esterases, na presença de inseticidas^79,80,81. Nesses estudos, as alterações detectadas envolveram esterases classificadas bioquimicamente como carboxilesterases e colinesterases, que são as duas classes de enzimas já referidas como associadas ao desenvolvimento de resistência. Esses trabalhos estão sendo continuados para melhor conhecimento das proteínas correspondentes às bandas.

Observa-se, assim, que o controle do A. aegypti é ainda um campo aberto à experimentação científica em muitos de seus aspectos, e tem como princípio a conscientização e educação da população. Isso nos coloca, basicamente, na dependência da ação do homem na eliminação dos criadouros para escapar de sua ação vetora em relação à dengue. Com a constante intervenção química utilizada durante as epidemias, pesquisas sobre novas alternativas de controle e resistência a inseticidas neste vetor são de fundamental importância.

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