Resumo

A constatação de que o tatu Dasypus novemcinctus infecta-se naturalmente pelo Paracoccidioides brasiliensis abriu perspectivas para estudos eco-epidemiológicos e de evolução deste patógeno. No presente estudo, foi investigada a ocorrência do P. brasiliensis em tatus capturados em uma reserva de Cerrado em Bauru, SP. Foram avaliados quatro animais (C1-C4), dos quais, após a eutanásia, foi feita a coleta de pulmão, fígado, baço e linfonodos mesentéricos para avaliação micológica e molecular. Fragmentos de DNA ribossomal foram amplificados por PCR e Nested-PCR utilizando primers específicos para P. brasiliensis. O isolamento fúngico foi positivo em três animais, nas amostras de linfonodo (C1), fígado (C4) e baço (C2 e C4). Amplicons de 387pb foram identificados em três amostras de tecido. A detecção de animais infectados na reserva de Cerrado aponta para a importância de utilizar esses animais como sinalizadores da presença do patógeno no ambiente, sendo esta uma avaliação inédita no município de Bauru, SP.

Palavras-chave: Paracoccidioides brasiliensis; Paracoccidiodomicose; Dasypus novemcinctus.

Abstract

The finding of naturally infected Dasypus novemcinctus armadillos by the fungus Paracoccidioides brasiliensis opened new perspectives for eco-epidemiological and evolution studies with this pathogen. In the present study the occurrence of P. brasiliensis in armadillos captured in the Cerrado Reservation area of Bauru/SP was evaluated. Four animals were captured (C1-C4) and after euthanasia lung, liver, spleen and mesenteric lymph nodes were collected for mycological and molecular evaluation. Ribosomal DNA fragments were amplified by PCR and Nested-PCR using P. brasiliensis specific primers. The fungus was isolated in three animals from lymph node (C1), liver (C4) and spleen samples (C2 and C4). In 3 tissue samples 387bp amplicons were identified. The detection of infected animals in the Cerrado Reservation area reiforce the use of these animals as sentinels for the presence of the pathogen in the environment. This is the first description of such evaluation in Bauru municipality.

Key words: Paracoccidioides brasiliensis; Paracoccidiodomycosis; Dasypus novemcintus.

Introdução

Fungos patogênicos são aqueles capazes de invadir tecidos sadios, multiplicar-se e provocar dano tecidual no hospedeiro imunocompetente. Os principais fungos patogênicos causadores de micoses sistêmicas são termodimórficos e apresentam: distribuição geográfica limitada às chamadas áreas endêmicas; ocorrência saprofítica em micronichos com produção de propágulos infectantes, que penetram no hospedeiro principalmente pelo trato respiratório¹. Dentre eles destacam-se: Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Emmonsia spp. e Paracoccidioides brasiliensis. Tratam-se de fungos ascomicetos, pertencentes à Ordem Onygenales e Família Onygenaceae.

Estudos recentes de filogenia molecular em diferentes espécies da Família Onygenaceae sensu latu indicam que o B. dermatitidis (A. dermatitidis), juntamente com o H. capsulatum (Ajellomyces capsulatus), E. crescens (Ajellomyces crescens) e o P. brasiliensis (fase sexuada ainda desconhecida) representam um clado natural, reconhecido com uma nova família, denominada Ajellomycetaceae². Além de compartilhar características micológicas e moleculares semelhantes, os membros dessa família apresentam uma ecologia normalmente associada a uma fase saprofítica ambiental em solos e fase parasitária associada a hospedeiros vertebrados². 

O conhecimento da biologia do P. brasiliensis vem aumentando nos últimos anos, principalmente devido à introdução de métodos moleculares para seu estudo. Esse fungo é o causador da paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica de natureza granulomatosa com freqüente evolução crônica, envolvendo principalmente a pele, linfonodos, pulmões e membranas nasal, oral e gastrointestinal³. A PCM é observada predominantemente em trabalhadores rurais ou pessoas com freqüentes contatos com alguns materiais ambientais (solo). Alguns fatores como alcoolismo, tabagismos e certo grau de desnutrição estão associados à maior ocorrência da doença⁴.

A área de maior prevalência é a América do Sul, sendo Brasil, Venezuela e Colômbia os países com maior número de pacientes⁵. Como a PCM não é uma doença de notificação compulsória sua real prevalência e incidência não podem ser calculadas. Entretanto, no Brasil, centro da área endêmica, estimativas indicam uma taxa de incidência anual de 1 a 3 por 100.000 habitantes e uma taxa média de mortalidade de 0,14 por 100.000 habitantes, sendo considerada a oitava causa de morte relacionada à doença de origem infecciosa⁶.

Apesar dos esforços contínuos de diversos grupos de pesquisa, principalmente do Brasil, Colômbia, Venezuela e Argentina, a fase ambiental produtora de propágulos infectantes, seu nicho ecológico e outros aspectos fundamentais da biologia desse patógeno ainda representam um enigma. Sabe-se, no entanto, que o tatu de nove-bandas (Dasypus novemcinctus), um mamífero que evoluiu na mesma área geográfica que o fungo P. brasiliensis, infecta-se naturalmente pelo fungo, permitindo novas perspectivas para estudos eco-epidemiológicos e também para fornecer dados sobre a evolução do patógeno⁷. O freqüente achado de que o tatu apresenta-se infectado pelo P. brasiliensis nos leva ao seguinte questionamento: a associação desse patógeno com o hospedeiro animal poderia ser uma estratégia para o fungo sobreviver na natureza ou a infecção ocorre ao acaso? Esse fato aponta para a necessidade de um melhor entendimento da relação parasita-hospedeiro estabelecida entre o tatu e o P. brasiliensis, bem como procurar o fungo em outros hospedeiros animais além dos tatus.

O conhecimento de reservatórios naturais de fungos patogênicos poderá contribuir para o mapeamento de regiões habitadas pelos fungos e o melhor conhecimento da epidemiologia das micoses.

Objetivo

O presente estudo teve como objetivo investigar a ocorrência do P. brasiliensis em tatus capturados em uma área de reserva de Cerrado localizada no Instituto Lauro de Souza Lima – órgão da Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo –, em Bauru, SP.

Material e métodos

Os animais foram capturados com armadilhas colocadas nas trilhas e/ou tocas dos animais, com a sua exata localização geográfica demarcada (22º19’55.90’’S, 48º57’28.82’’O), sob licença do – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovaveis – Ibama (n^o 187/2005, processo 02027.015113/95-07). Foram avaliados quatro animais machos (C1-C4), os quais foram anestesiados (Zoletil 50 – Virbac, 0,2mL/Kg) e, posteriormente, submetidos à eutanásia para a coleta dos órgãos (pulmão, fígado, baço e linfonodos mesentéricos) tanto para avaliação micológica quanto molecular. Foi realizada a prévia assepsia dos órgãos, seguida por semeadura de 70-80 fragmentos de 2-4mm³ de cada tecido em meio Mycosel ^® (placas em triplicata) com incubação a 35ºC, por um período de oito semanas⁸. Colônias com características macro e microscópicas semelhantes ao P. brasiliensis foram isoladas em tubos contendo GPY e BDA, estocadas e caracterizadas por métodos moleculares. A análise molecular consistiu da extração de DNA, empregando-se o kit Genomic Prep™ Cells and Tissue DNA Isolation (GE Healthcare), e amplificação por reações de PCR e Nested-PCR, com primers específicos para P. brasiliensis derivados da região do DNA ribossomal.

Resultados

O isolamento fúngico positivo de P. brasiliensis foi observado nas amostras de linfonodo mesentérico (animal C1), fígado (animal C4) e baço (animais C2 e C4), fato que confirma a alta freqüência de infecção e facilidade de recuperação fúngica nessa espécie animal. Amplicons específicos de 387pb também foram identificados em amostras de tecido de três exemplares (animais C1, C2 e C4), como ilustrado na Figura 1C.

Figura 1 -  A) Dasypus novemcinctus capturados no Instituto Lauro de Souza Lima, Bauru, SP. B) Microscopia do P. brasiliensis em sua fase leveduriforme, obtida do fígado do tatu C2, coloração com lactophenol azul algodão e aumento 400X. C) Nested-PCR com os primers PbITSE/PbITSR em amostras de DNA extraídas das vísceras de tatus (C1-C4). Linhas 1-13: 1) marcador de peso molecular 100pb (Invitrogen); 2) pulmão (C1); 3) fígado (C1); 4) baço (C1); 5) linfonodo mesentérico (C1); 6) pulmão (C2); 7) fígado (C2); 8) baço (C2); 9) pulmão (C3); 10) fígado (C3); 11) baço (C1); 12) pulmão (C4); 13) fígado (C4); 14) baço (C4); 15) controle positivo (DNA de cultura de P. brasiliensis); 16) controle negativo.

Discussão

A constatação de que a infecção natural pelo P. brasiliensis nos tatus é alta e de que esses animais são importantes sinalizadores da ocorrência do patógeno no ambiente já esta bem documentada; isso abriu novas oportunidades para os estudos ecológicos desse fungo^7,9.

No nosso trabalho, 75% dos animais (3/4) estavam infectados, índice semelhante ao encontrado na região de Botucatu, SP⁸. Porém, os isolamentos de P. brasiliensis em tatus apresentam uma variação de 20% a 75% de positividade nos animais investigados. Naiff et al. ^10,11 detectaram P. brasiliensis em 22/50 (44%) tatus capturados no Estado do Pará. Silva-Vergara et al.^12,13, isololaram P. brasiliensis de cinco tatus dos 37 avaliados em Minas Gerais, e Corredor et al.^14,15 obtiveram isolamento positivo em dois tatus, sendo um D. novemcinctus e outro Cabassous centralis, na Colômbia.  

Muitas circunstâncias fazem os tatus importantes animais para pesquisas. O tatu de nove-bandas vive em uma extensa região das Américas, uma distribuição que parcialmente coincide com a PCM em humanos¹⁶. Esse animal exibe contato freqüente com o solo, principalmente pelo seu hábito escavatório. Essa atividade pode expor os tatus aos propágulos infecciosos presentes no ambiente. Estudos de caracterização molecular de isolados humanos e animais indicam que os mesmos ecopatogenótipos devem estar infectando ambos os grupos de hospedeiros (humanos e tatus)^17,18.

A detecção de tatus naturalmente infectados na reserva de Cerrado do ILSL aponta para um importante fator, que é a utilização desses animais como indicadores da presença do P. brasiliensis nesse ambiente, uma vez que essa avaliação é inédita no município de Bauru, SP. A área de ocorrência do patógeno nesses animais é considerada de preservação ambiental, contendo vários hectares de vegetação natural, onde está inserido o Instituto, que é centro de referência para o tratamento da hanseníase e outras moléstias infecciosas, incluindo as fúngicas.

Nessa área existem pacientes portadores de hanseníase, já tratados e sob tratamento, que moram em casas do ILSL há décadas. Para esses pacientes especiais, portanto, a proximidade com o habitat do P. brasiliensis parece ser uma realidade concreta. Embora seja necessária uma melhor avaliação do possível significado desses animais infectados como facilitadores da infecção humana, até o momento não existe qualquer evidência de que o P. brasiliensis possa estar infectando as pessoas que freqüentam o local. Por outro lado, a caça aos tatus nesses locais deve ser totalmente evitada, uma vez que já se comprovou que esse hábito constitui em um fator de risco para a PCM⁹.

Apoio financeiro: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp) – 05/56771-9 e 06/03597-4.

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